《表2 荧光定量PCR引物序列》

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《代乳粉水平对羔羊血液指标和肠道屏障功能的影响》

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使用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit(Takara，Kusatsu，Japan）提取回肠组织和结肠组织总RNA，并使用Transcript First-Strand c DNA Synthesis SuperMix试剂盒（TransGen Biotech，Beijing，China）反转录为c DNA。使用Primer 5.0软件（PREMIER Biosoft International，Palo Alto，CA）设计肠道紧密连接蛋白（Claudin1、Claudin4和Occludin）、Toll样受体-4(TLR4）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）基因引物，并通过将扩增片段连接到T载体克隆后提取质粒梯度稀释的方法验证引物特异性和扩增效率（表2）。通过Roche LightCycler 480 II荧光定量PCR仪（Roche Diagnostics，Mannheim，Germany）分析基因表达水平。PCR程序为：95℃30s；然后进行40个循环：95℃5秒，55℃30秒，72℃30秒。采用β-Actin作为内参，采用2-ΔΔCT法进行数据分析[15]。