《表1 qRT-PCR引物序列》

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《长链非编码RNA DLX6-AS1在食管鳞癌中的表达水平及与预后的关系》

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（1）总RNA提取：于-80℃冰箱中取出食管鳞癌患者癌组织及癌旁组织，快速称取50mg，采用TRIzol?试剂进行组织总RNA提取，操作严格按照说明书进行，利用紫外可见光分光光度计计测RNA样品的纯度及浓度（A260/A280=1.8～2.1）。（2）反转录合成cDNA：采用PrimeScriptTMRT Master Mix试剂盒进行反转录合成cDNA，反应体系为总RNA提取物2μL，5×PrimeScript RT Buffer 4μL，Random 6 mers 1μL，Oligo dT Primer 1μL，RNase Inhibitor 1μL，PrimeScript RTase 1μL，dNTP Mixture 2μL，DEPC水8μL，总体系20μL。反应条件为37℃60 min、85℃3 min，合成cDNA-80℃保存备用。（3）实时荧光定量PCR：以cDNA产物为模板进行实时定量聚合酶链锁反应（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR)，cDNA产物2μL，2×SYBR?Premix Ex TaqTMII 8μL，上下游引物各1μL，50×ROX Reference Dye 0.4μL，RNaseFree H2O 7.6μL，总体系20μL。反应条件：95℃、10 min预变性（1个循环）后，设置95℃、15 s，60℃、1 min(40个循环）。以GAPDH为内参，二者引物序列见表1；样品设置3个重复，以2-△△Ct方法计算癌组织与癌旁组织中LncRNA DLX6-AS1的相对表达量。