《表2 引物序列(2)：利用基因工程改造的大肠杆菌合成蒎烯》

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《利用基因工程改造的大肠杆菌合成蒎烯》

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下划线序列为酶切位点

首先将GPPS去掉终止密码子后利用一个柔性的linker串联PS基因，再以pET-24a（a）为基础构建融合表达载体。根据融合PCR的原理设计扩增GPPS和PS的2对引物（表2），在GPPS的5'端引入Bam HⅠ酶切位点，PS的3'端引入XhoⅠ酶切位点，基因间linker序列为GGTTCTGGT。第1次PCR分别扩增GPPS和PS基因[98℃30 s；98℃20 s，62℃（GPPS）/63℃（PS）20 s，72℃50 s（GPPS）/60 s（PS），30个循环；72℃2 min]；第2次扩增以第1次扩增的GPPS和PS的PCR胶回收产物为模板、GPPS2-F与PS2-R为引物，扩增GPPS-PS融合片段（98℃30 s；98℃20 s，63℃20 s，72℃2 min，30个循环；72℃2 min）。对扩增后的胶回收产物和载体pET-24a（+）进行酶切连接，产物转化大肠杆菌感受态细胞，转化子酶切测序鉴定，鉴定正确的质粒命名为pET24a-GPPS-PS。