《表1 引物设计和合成：胎盘特异性基因4 mRNA基因在孕妇外周血中的检测及临床价值》

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《胎盘特异性基因4 mRNA基因在孕妇外周血中的检测及临床价值》

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（1）血清学筛查:孕中期采用以AFP+β-HCG为母体筛查标记物的二联的血清学筛查法。使用Au-toDELFIA自动时光分辨检测系统，试剂盒源于PekinElmer公司，采用LifeCycle统计软件处理分析，以大于1/270为阳性切断值[16-18]。（2）标本的采集和处理（二步离心法）:抽取研究对象空腹、肘前静脉血2 m L，EDTA抗凝（在获得血浆之前4℃保存不超过6h）。4℃下1600×g离心10 min，将上层淡黄色液体全部转移至一无DNA酶的1.5 m L无菌Ep管内，再在4℃下16000×g离心10 min，收集上层淡黄色液体转移至无DNA酶的1.5 m L无菌Ep管内，-70℃保存待用。（3）血浆中总RNA的提取（购于西安依科生物技术有限公司的游离RNA血清血浆提取试剂50 m L(cw2281A）):每1 m L的血浆加入3倍体积的游离RNA提取试剂，充分混匀后，室温静置5分钟；加入0.6 m L的氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置2分钟，4℃12000 rpm离心20分钟；取上清加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置30分钟，4℃12000 rpm离心20分钟，弃上清；加入3 m L 75%乙醇洗涤沉淀，4℃12，000 rpm离心3分钟；小心吸弃上清，室温放置3分钟，晾干；加入30μL无RNase的水，充分溶解RNA。-70℃保存。并应用紫外分光光分度计对RNA质量浓度和纯度进行检测。（4）总RNA的逆转录（ExScriptTM RT Reagent Kit(Perfect Real Time）（DRR037S）):反应体系为20μL，其成分为5×PrimeScript Buffer（for Real Time）4μL，PrimeScript RT En zyme Mix I 1μL，Oligo dT Primer（50μM）1μL，Random 6 mers（100μM）1μL，Total RNA7μL，RNase Free dH2O 6μL；反应条件:37℃15分钟，85℃5秒钟，-20℃保存。见表1。（5）PLAC4m RNA基因检测:普通PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳的定性检测（主要购于西班牙Agarose公司及西安润德生物技术有限公司）和实时荧光定量PCR定量检测（美国ABI公司实时定量PCR仪Step one）。（6）随访唐氏筛查高危孕妇的妊娠结局。