《表1 引物信息：牛ANO1基因为胎盘特异的父源印记基因》

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《牛ANO1基因为胎盘特异的父源印记基因》

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使用DNA甲基化分析试剂盒（Zymo，美国）将牛基因组DNA进行亚硫酸氢盐处理。从NCBI数据库获取牛ANO1基因及其上游5 000 bp的DNA序列，利用MethPrimer在线软件（http：//www.urogene.org/methprimer）对以上序列进行CpG岛预测，并对预测后的序列设计巢式PCR引物。巢式PCR外侧引物为Outside F1/R1，扩增序列长度为832 bp；巢式PCR内侧引物为Inside F2/R2，扩增序列长度为522 bp（表1）。PCR外侧引物扩增体系同1.2.2；PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，共34个循环；72℃延伸5 min。将PCR产物稀释20倍后取1μL作为内侧引物扩增的模板，PCR反应体系同1.2.2，PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，共34个循环；72℃延伸5min。第二次PCR产物按照1.2.2步骤进行回收，将部分回收产物直接测序。