《表1 q RT-PCR引物序列》

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《儿童1型糖尿病外周血中微小RNA-155和T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3的表达关系及临床意义》

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禁食8 h，于次日晨空腹抽取肘静脉血5 ml，平均分成2份，1份通过密度离心法[5]分离单个核细胞（PMBC），-80℃保存；另1份-4℃3000 r离心20 min，吸取上清液置于离心管内，-20℃保存，现用现融。取-80℃保存的静脉血，冰袋上解冻后按照Trizol试剂盒说明书操作，提取外周血PMBC RNA。-20℃保存的静脉血冰袋上解冻后按照Trizol试剂盒说明书操作，提取外周血总RNA。按照miRNA反转录试剂盒操作步骤将2μgRNA反转录为cDNA，之后按照SYBR Green RCR master mix试剂说明配反应体系并加样。qRT-PCR反应体系共20μl:SYBR Premix Ex TaqⅡ（2×）10μl，cDNA 2.0μl，上下游引物各0.8μl，ROX Reference DyeⅡ（50×）0.4μl，ddH2O 6.0μl。完成后将其放入荧光定量PCR仪上进行反应，程序设定为：95℃30 s，95℃15 s，60℃15 s，72℃15 s，共40个循环，72℃终延伸10 min。miR-155以U6为内参基因，Tim-3以β-actin为内参基因，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物设计见表1。反应结束后收集数据，并对所得数据Ct值进行分析，采用2-ΔΔCt计算miR-155、Tim-3 mRNA相对表达量。