《表1 PCR扩增所需引物序列》

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《阻断辅因子NADPH合成对谷氨酸棒杆菌生长及产物合成的影响》

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注:下划线为酶切位点。

根据NCBI中C.glutamicum ATCC 13032基因序列设计zwf基因上下游以及中间引物，引物序列如表1。提取C.glutamicum ATCC 13032基因组为模板，分别以zwf-L-F/zwf-L-R和zwf-R-F/zwf-R-R为引物PCR，获得分别在3’端和5’端有相同限制性内切酶酶切位点的PCR产物zwf-L、zwf-R。将胶回收后的基因片段zwf-L和重组自杀型质粒载体pK18mobsacB通过Hind III和Sal I双酶切，纯化后将zwf-L和线性化质粒pK18mobsacB 22℃过夜酶连，转化E.coli JM109，经抗性平板筛选，挑取转化子菌落PCR，选取较亮条带对应的单菌落液体培养后提取质粒酶切验证，构建质粒p K18mobsacB-Δzwf-L。用同样的方法将基因片段zwf-R连接至质粒pK18mobsacB-Δzwf-L上构建重组自杀型质粒p K18mobsacB-Δzwf。通过相同的方法构建质粒pK18mobsacB-ΔmalE。