《表1 PCR扩增引物序列》

《表1 PCR扩增引物序列》   提示:宽带有限、当前游客访问压缩模式
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《新型四环素药物Eravacycline体外诱导金黄色葡萄球菌耐药16S rRNA基因突变位点分析》


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16S rRNA的5个拷贝基因片段:RR1(2 086 bp)、RR2(2 075 bp)、RR3(1 936 bp)、RR4(1 756 bp)和RR5(2 345 bp)。引物委托北京六合华大基因公司合成(引物Primer5.0软件设计,引物序列见表1)。采用TAKARA试剂盒提取菌株基因组DNA,-20℃保存备用。采用PCR方法检测基因RR1、RR2、RR3、RR4和RR5,扩增条件如下:反应体系50μL,Dream Taq Green PCR Master Mix(2×)25μL,Forward primer1μL,Reverse primer 1μL,Template DNA 2μL,加dd H2O补齐至50μL。PCR反应条件:95℃预变性5 min,95℃变性30 s,RR1、2、3、4、5,S3,S10的退火温度分别为50℃,49℃,51℃,RR1、2、3、4、5,S3,S10的延伸时间分别为2 min,1 min,1 min,共35个循环,72℃后延伸10 min,PCR产物于4℃保存。PCR反应产物均用1%的琼脂糖凝胶电泳,对电泳阳性产物送华大基因公司测序,测序结果采用DNAMAN比对诱导株和拷贝16S rRNA序列与野生株间差异寻找变异位点。同样方法扩增30S核糖体亚基蛋白S3和S10,通过变异株和母株基因比对寻找耐药相关变异位点。