《表1 用于原花叶病毒特征鉴定的引物》

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《甘薯卷叶病毒LAMP快速检测技术的建立及应用》

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SPLCV:甘薯卷叶病毒；LAMP:环介导恒温核酸扩增；下同

样品DNA提取方法参照Easypure?Plant Genomic DNA Kit提取，提取的样品DNA置于-20℃冰箱，备用。利用双生病毒的通用引物PA/PB（表1）进行PCR扩增，PCR扩增体系为25μL:1.0μL DNA模板（10～50 ng/μL），10μmol/L上、下游引物1.0μL，DNA Taq酶（2×Easy Taq@PCR SuperMix）12μL，用ddH2O补足体系至25μL。PCR反应程序设置为:94℃预变性3 min；94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，循环5次；94℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸1 min，循环25次；72℃延伸l0 min，反应结束后4℃保存。特异性PCR扩增体系为25μL:1.0μL DNA模板（10～50 ng/μL），上游引物SPLCV-F和下游引物SPLCV-R（10μmol/L）各1.0μL，12μL DNA Taq酶（2×Easy Taq@PCR SuperMix），ddH2O补足25μL。反应程序:94℃预变性3min；94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1min，循环5次；94℃预变性3 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，循环25次；72℃延伸l0 min，反应结束后4℃保存。取PCR扩增产物3μL进行琼脂糖凝胶电泳（1%的琼脂糖凝胶），凝胶中加入GeneGreen进行染色，电泳缓冲液为0.5%TAE（三羟甲基氨基甲烷 （tris base），乙酸（acetic acid）和乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）） ，120 V电压下电泳35 min，凝胶成像仪观察拍照。