《表1 用于杭白菊叶枯病病原菌分子鉴定的引物》

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《杭白菊叶枯病病原菌鉴定及其对多菌灵的抗性机制》

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从1.2.1分离保存的菌株中随机选择YK-YJQ-10、YK-YY-1、YK-LZ-9、YK-LZ-10、YK-LJQ-3和YK-LJQ-4菌株进行分子鉴定。将纯化后的菌株分别在PDA平板上25℃下黑暗培养7 d后，刮取菌丝，按照真菌基因组DNA快速抽提试剂盒说明书提取病原菌基因组DNA。分别设计扩增核糖体内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）、nrDNA大亚基（large subunit，LSU）和β-微管蛋白基因（β2-tubulin，TUB2）的通用引物（表1），所用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。50μL PCR扩增体系：10μmol/L上下游引物各2μL、病原菌DNA1μL、2×Taq PCR Master Mix 25μL，ddH2O补足至50μL。LSU的扩增程序：95℃预变性2 min；95℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸40 s，35个循环；72℃延伸10 min。ITS和TUB2的PCR退火温度分别为55℃和53℃，其余步骤同LSU（张佳星等，2018）。利用测序所得TIS、LSU和TUB2基因序列进行联合系统发育分析（Pearce et al.，2016）。将本试验所得菌株及从GenBank下载获得的参比菌株各基因序列使用MAFF 7.037b软件进行多重比较，采用GBLOCKS 0.91b软件进行保守区域选择，应用SequenceMatrix 1.7.8软件将各基因串联成数据集，并用Mega 5.0软件以邻接法（neighbor joining，NJ）构建系统发育树，重复1 000次（Chen et al.，2015）。