《表1 本研究所用引物列表》

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《柱花草甲壳质酶基因SgGH19-1的克隆表达及酶学性质分析》

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柱花草PR-3同源基因的克隆参照Liu等[15]的方法。首先，对不同植物中的PR-3基因进行多序列比对，包括拟南芥（Arabidopsis thaliana）的At3G12500(AtPR-3）、大豆（Glycine max）的Glyma02g04820、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）的Medtr8g074330和菜豆（Phaseolus vulgaris）的Phvul.003G268500。根据这些基因的保守序列设计同源克隆引物SgPR-3-EST-F/R（表1），以热研2号柱花草的cDNA为模板，通过PCR扩增及测序获得柱花草PR-3同源基因的EST片段序列。随后，采用的SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒（Clotech，美国）扩增柱花草PR-3基因的5′末端和3′末端。即根据获得的EST序列分别设计正向和反向引物SgPR-3-5′RACE-R和SgPR-3-3′RACE-F，分别与试剂盒中的通用引物RACE-UPM和RACE-NUP（表1）配对，通过RACE扩增得到5′和3′端序列，拼接后获得柱花草PR-3基因的cDNA全长序列，并用引物SgPR-3-ORF-F/R（表1）扩增全长序列。基因多序列比对、氨基酸序列比对和进化树构建分别采用DNAMAN、Clustal X和MEGA5软件。根据同源比对结果，将柱花草PR-3基因命名为SgGH19-1。