《表1 本研究所用引物信息》

  提示：宽带有限、当前游客访问压缩模式

本系列图表出处文件名：随高清版一同展现

《棉铃虫剂量补偿相关基因Hamsl1的鉴定与功能分析》

1. 获取 高清版本忘记账户？点击这里登录

1. 下载图表忘记账户？点击这里登录

Trizol法提取棉铃虫雌雄成虫RNA，使用RQ1RNase-free DNase和RNase Inhibitor处理总RNA样品，去除基因组DNA（gDNA）污染。以总RNA为模板，加入RNase-free Water至各个样品的RNA浓度均为1 000 ng/μL，使用FastQuant RT Kit试剂盒合成cDNA。棉铃虫msl1同源基因序列通过利用果蝇msl1基因序列（GenBank登录号:NM＿057548.4，NM＿001299125.1）和家蚕msl1基因序列（GenBank登录号:NM＿001099836.1）BLAST到本实验室建立的棉铃虫基因组和转录组数据库中（Zhang et al．，未发表）获得。获得的所有转录本与基因组比对，确定是否含有选择性剪接。并与2017年已公布的棉铃虫基因组序列（GenBank登录号:PRJNA378437）进行比对验证。根据检索获得的序列利用引物设计软件Primer Premier 5.0设计Hamsl1基因全长上下游克隆引物Hamsl1-upstreamF，Hamsl1-upstream-R，Hamsl1-downstream-F和Hamsl1-downstream-R（表1），扩增开放阅读框序列（ORF），引物跨选择性剪接区域两端设计，以棉铃虫成虫雌雄的cDNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增体系（50μL）:10×PCR Buffer（含Mg2+）5μL，d NTP Mixture 4μL，Ex Taq Polymerase 0.25μL，正反向引物（10μmol/L）各2μL，cDNA模板2μL，ddH2O 34.75μL。PCR反应条件:95℃预变性3 min；95℃10 s，60℃30 s，72℃2 min，35个循环；72℃延伸10 min。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳分离并回收目的条带，连接到克隆载体pGEM-T Easy上室温孵育3 h（或4℃过夜），连接产物转化到DH5α感受态细胞，加500μL LB液体培养基置于培养箱中37℃150 r/min培养1 h，取100μL菌液涂在含Ampicilin/X-gal/IPTG的LB平板上，置于培养箱中37℃倒置培养12～16 h。蓝白斑筛选后挑取阳性单克隆在含1 m L 0.1%Amp的LB液体培养基中培养过夜。经菌液PCR挑取含有目的条带大小的菌液送华大基因测序验证。