《表1 本研究所用引物信息》

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《两个马铃薯Y病毒黑龙江马铃薯分离物株系鉴定》

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M=A/C，Y=C/T.

针对PVY全基因组序列保守区域设计3对引物1-F/1-R、2-F/2-R、3-F/3-R和反转录引物Oligo（dT）18（表1），分3段扩增所得分离物的ORF区域。引物均由北京六合华大基因科技有限公司合成。首先利用植物RNA提取试剂盒提取马铃薯样品KS4和KS7的总RNA，以Oligo（d T）18为引物反转录合成cDNA。将植物总RNA 4μL、Oligo（d T）18和任意6个核苷酸组成的随机引物各1μL加入PCR管中，70℃变性10 min后迅速放置冰上2 min。然后加入5×M-MLV反转录酶缓冲液2μL、200 U/μL M-MLV反转录酶0.25μL、40 U/μL RNA酶抑制剂0.25μL、10 mmol/L d NTP 0.5μL、不含RNA酶的蒸馏水1μL，30℃处理10 min，42℃反转录1 h，70℃钝化反转录酶15 min。将获得的cDNA于-20℃保存备用。其次，利用合成的cDNA为模板扩增PVY全基因组序列。50μL PCR反应体系：10×LA PCR缓冲液5μL、2.5 mmol/L dNTP 2μL、5 U/μL LA Taq DNA聚合酶0.5μL、10μmol/L上下游引物各1μL、cDNA 2μL、ddH2O 38.5μL。反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，不同引物在各自退火温度下（表1）退火30 s，72℃延伸（延伸时间按1 kb/min计算），32个循环；最后72℃延伸10 min，4℃保存。利用1%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，切胶回收后连接到p MD18-T载体上。将连接产物转化DH5α感受态细胞，通过菌落PCR鉴定筛选阳性克隆并送铂尚生物技术（上海）有限公司进行测序。将测序所得序列用DNA-STAR中的SeqMan进行拼接，得到分离物KS4和KS7的ORF序列。