《表1 本研究所用的引物》

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《利用CRISPR-Cas9技术制备水稻LOC＿Os01g07170突变体》

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将CRISPR引物170-1F/R和170-2F/R退火，插入CH载体中，与Cas9载体酶切连接。测序确定连接正确之后，将测序正确的载体命名为p1300-CH-T1和p1300-CH-T2。将载体p1300-CH-T1以及p1300-CH-T2转入到农杆菌EHA105中，用JD-1F/R和JD-2F/R进行PCR鉴定。通过农杆菌介导的植物转化方法，将p1300-CH-T1和p1300-CH-T2载体分别转入野生型水稻9522愈伤组织中，在培养基中加入用潮霉素，筛选潮霉素抗性苗。待苗长大后，取一小片叶片，用CTAB法提取叶片DNA，用载体特异性引物UbiR2/P2（表1）鉴定阳性苗是否携带目的片段。PCR结果显示p1300-CH-T1敲除构建共获得7株转基因苗，p1300-CH-T2敲除构建共获得11株转基因苗（图4）。