《表1 实验所用引物及其序列》

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《中华绒螯蟹胰脂酶基因克隆及表达分析》

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本研究以反转获得的中华绒螯蟹肝胰腺cDNA为模板，利用特异性引物F1和R1（表1）扩增获得了中华绒螯蟹胰脂酶基因序列片段，共850 bp。3'RACE扩增获得了1 099 bp的3'端序列片段。5'RACE采用巢式PCR进行，其5'GSP-1扩增产物长度约为1 100 bp，二次PCR扩增后获得了953 bp的5'端片段。通过对上述序列进行拼接后，本研究得到一条长为1 970 bp的中华绒螯蟹胰脂酶基因cDNA序列（GenBank登录号:MG456862）。对中华绒螯蟹胰脂酶序列进行分析表明，该基因序列开放阅读框（ORF）长度为1 374 bp，共编码457个氨基酸，5'和3'非编码区（UTR）长度分别为372 bp和224 bp。对中华绒螯蟹胰脂酶基因的理化分析表明，中华绒螯蟹胰脂酶包含457个氨基酸，其中天冬氨酸（Asp）含量最高为9.4%，其次为含量9.0%的亮氨酸（Leu）。预测分子量为51.066 kD，理论等电点为4.65。该蛋白质不稳定系数为30.72，属于稳定蛋白，脂肪族氨基酸指数为80.90。通过NCBI蛋白质Blast对中华绒螯蟹胰脂酶氨基酸序列进行分析（图1）的结果表明，在117 aa、140 aa和225 aa处检测到了脂肪酶特征性的催化三联体S-D-H（Ser-AspHis）；在200～202 aa和222～223 aa处预测到了脂肪酶活性位点“盖子（Flap）”结构；115～119 aa处预测到了脂肪酶特性的“亲核弯”结构。