《表1 本实验引物：柠条锦鸡儿木质素合成关键基因CkCOMT的克隆及表达载体构建》

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《柠条锦鸡儿木质素合成关键基因CkCOMT的克隆及表达载体构建》

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表达载体的构建，采用的是In-fusion方法:全长特异性引物的5'端包含15 bp与载体序列同源的核苷酸序列，在In-fusion体系下，目的片段与线性载体连接。提取表达载体pCanG-HA质粒，并在SalⅠ和SpeⅠ内切酶酶切，使载体线性化，CkCOMT基因全长克隆引物COMT-OVER-1和COMT-OVER-2（表1）。该基因以柠条锦鸡儿cDNA为模板克隆并胶回收目的产物后，按照Infusion方法，与p CanG-HA线性化载体连接，转化大肠杆菌DH5α。次日挑取单菌落PCR鉴定重组菌（图8A），选取PCR条带与CkCOMT基因序列大小一致的菌落过夜培养。菌液测序并提取重组质粒，经SalⅠ和SpeⅠ内切酶切割验证（图8B），1号泳道为pCanG-CkCOMT-HA重组质粒电泳，2号泳道为pCanG-CkCOMT-HA重组质粒双酶切电泳结果，酶切产生目的产物大小位于1 000 bp左右，与预期1 098 bp大小一致，说明该表达载体构建成功。同时，测序结果显示该片段的确为CkCOMT基因。