《表1 引物序列：水稻耐盐基因SKC1特异性分子标记开发及应用》

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《水稻耐盐基因SKC1特异性分子标记开发及应用》

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注:下划线核苷酸表示错配碱基；加粗核苷酸为功能SNP

依据PCR-CTPP（Polymerase chain reaction with confronting two-pair primers）方法原理（Hamajima et al.，2002），我们最开始在设计SKC1 C型等位基因鉴定引物时（图1）:在该SNP的上游200多bp的地方设计了正向引物811F，以该SNP位点C的互补碱基G为3'端设计了内部反向引物1039IR（表1），从原理上讲，1039IR的3'端的G碱基与C型等位基因配对进行PCR扩增延伸而与G型等位基因因为G/G错配无法正常扩增，实验结果表明该3'末端的单碱基错配在G型等位基因中也有一定的PCR产物，因此并不能完全区分2种基因型；为增强引物特异性，我们参考王柯等（2011）的设计原理，在引物1039IR 3'末端的倒数第三位人工引入C/C碱基错配来增强PCR特异性，结果证明该引物对C型等位基因模板PCR时有234 bp的扩增产物，对G型等位基因模板PCR没有扩增产物；同理，在设计G型等位基因鉴定引物时，该SNP位点的G碱基作为3'端在该位点设计正向引物1039IF（图1），以该SNP位点下游设计外部反向引物1451R，同时在内部正向1039IF的倒数第三位也引入了G/T错配碱基来增强PCR扩增的特异性（表1）。