《表1 试验所用引物：P119驱动amiRNA介导的PL基因沉默对草莓果实硬度的影响》

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《P119驱动amiRNA介导的PL基因沉默对草莓果实硬度的影响》

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注:引物序列中小写字母为同源重组接头序列。

采用改良CTAB法[18]提取沉默处理和H2O处理草莓果实总RNA，经电泳检测及核酸蛋白测定仪测定浓度后，参照反转录试剂盒（宝生物）说明书合成cDNA用于后续PCR试验。根据克隆得到的草莓PL核酸序列，在miRNA靶点外设计半定量引物PL-1F和PL-1R，并以actin-smF和actinsmR（表1）为内参引物。同时采用实时荧光定量PCR技术进行PL表达量分析（表1）。半定量PCR体系为:稀释10倍的cDNA作为模板，上、下游引物各1μL，2×Taq Master Mixture 10μL，ddH2O 7μL。扩增程序为94℃5 min；94℃30 s，58℃30 s，72℃35 s，设置梯度循环数寻找最佳循环。在最佳循环数下进行处理组和对照组的PCR扩增，每个处理3组，每组重复3次。于QuantityOne（v4.6.2）软件中计算灰度值。定量PCR在CFX96（BioRad，美国）荧光定量PCR上进行，反应体系为20μL，含10μL SYBR Green mix（上海生工，含2 mmol·L-1MgCl2），上游引物PL-RTF 10μmol·L-1，下游引物PL-RTR 10μmol·L-1。采用三步法进行扩增:95℃预变性2.5 min，40个循环扩增（95℃变性15 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s）。每循环延伸结束进行荧光采集。最后95℃维持15 s，65℃起按0.5℃步进升温至95℃，每步维持5s并采集荧光信号。内参采用actinRTF和actin-RTR为引物。采用2-ΔΔCt进行表达量计算。