《表3 PCR引物序列：SMAD1基因的沉默和过表达及对秦川牛原代成肌细胞生肌的影响》

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《SMAD1基因的沉默和过表达及对秦川牛原代成肌细胞生肌的影响》

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用Primer 5.0软件根据牛SMAD1基因m RNA序列设计特异性引物（表3），并在引物中引入酶切位点Nhe I和Not I。以原代成肌细胞c DNA为模板扩增CDS区序列，产物长1 452 bp。PCR体系为:含模板的DNA100ng、正反向引物各4μL、dNTP Mix（2.5mmol·L-1）4μL、FastPfu polymerase 1μL、5×FastPfu buffer 10μL，用灭菌蒸馏水补足50μL。PCR扩增条件:95℃3 min；95℃20 s，55℃30 s，72℃2 min，30个循环；72℃5 min。将PCR产物经双酶切（Nhe I和Not I）回收后与p DC316-mCMV-EGFP真核表达载体大片段进行连接，22℃反应2h。反应体系为:目的片段6μL、pDC316-mCMV-EGFP大片段2μL、10×DNA Ligase Buffer 1μL、T4 DNA Ligase 1μL。将上述连接产物取10μL与100μL JM109感受态细胞均匀混合，冰浴30min后42℃热激45s，再立即冰浴2min，加入预热至室温的400μL LB培养基后37℃摇床培养1h，以4 000r/min离心1min后弃去400μL培养上清，再用移液器将剩余100μL吹打混匀后涂布于LB平板上（氨苄抗性含100μg·mL-1），37℃恒温培养箱倒置培养过夜。次日挑取2个单克隆菌落并接种到5ml含氨苄抗性的LB培养液（氨苄浓度为100μg·mL-1）中，250r/min，37℃恒温摇床培养过夜，用小量质粒抽提试剂盒抽提质粒，质粒经Nhe I和Not I双酶切鉴定无误后，送上海生工生物工程股份有限公司进行测序。