《表1 本研究所用引物：通过GbF3'H基因单独沉默及其与GbCHI和GbDFR基因共沉默研究其在海岛棉中抗枯萎病功能》

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《通过GbF3'H基因单独沉默及其与GbCHI和GbDFR基因共沉默研究其在海岛棉中抗枯萎病功能》

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注：下划线表示XbaⅠ和KpnⅠ酶切位点。Note:Enzyme restriction sites for XbaⅠand KpnⅠare underlined.

以本实验室前期的转录组数据和荧光定量筛选为基础[26]，利用转录组测序拼接得到的Unigene序列，结合NCBI数据库中Blast搜索结果，获得类黄酮代谢途径关键基因的编码区，提取经枯萎病菌处理后的海岛棉06-146下胚轴的RNA，逆转录成cDNA为模板，通过聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）克隆海岛棉类黄酮代谢途径关键基因GbF3'H的开放阅读框（Open reading frame，ORF）序列，进行琼脂糖凝胶纯化回收，回收产物用于转化大肠杆菌，用测序正确的GbF3'H基因大肠杆菌菌液提取质粒，用于扩增构建VIGS载体所需的片段。从海岛棉GbF3'H基因的保守区域中选取带特异位点的395 bp核苷酸序列设计引物，并在引物的5'端分别加入限制性内切酶XbaⅠ和KpnⅠ的酶切位点和保护碱基（表1），扩增海岛棉GbF3'H基因ORF上位于27～421 bp的片段，目标扩增片段长度为395 bp，送北京六合华大基因科技有限公司测序正确后，提取质粒，用XbaⅠ和KpnⅠ双酶切，酶切产物进行琼脂糖电泳胶回收。同时，用XbaⅠ和KpnⅠ双酶切VIGS病毒载体pTRV2质粒，并进行胶回收。上述双酶切后的目的片段与载体使用T4DNA连接酶进行连接，连接产物转化至大肠杆菌中，通过菌液PCR筛选阳性克隆，提取质粒，经酶切验证获得重组质粒pTRV2-GbF3'H，将提取的质粒转入农杆菌，扩大培养农杆菌菌液用于后续试验。