《表1 本实验所用引物：三角帆蚌Dmrt1基因的分子特征和表达研究》

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《三角帆蚌Dmrt1基因的分子特征和表达研究》

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在本研究实验室的三角帆蚌转录组数据库中搜索了与HcDmrt1基因相似的EST序列。EST的序列分析表明，HcDmrt1 cDNA在3'末端不完整，基于鉴定的EST序列，设计了2对基因特异性引物以扩增HcDmrt1的3'末端，通过巢式PCR和cDNA末端的快速扩增（3'-RACE）（表1）。所有PCR反应均在25μL终体积中进行，该体积含有2.5μL 10×PCR缓冲液、2.0μL dNTP（2.5 mmol/L）、0.6μL各引物（25 mmol/L）、18.5μL PCR-grade water、0.2μL（1 U）Taq聚合酶（TaKaRa，Dalian，China）和0.6μL cDNA模板。将PCR产物凝胶纯化并克隆到pMD18-T简单载体（TaKaRa，Dalian，China）中。转化入大肠杆菌DH5α的感受态细胞后，通过PCR检测鉴定重组体。阳性生物技术（上海）有限公司对阳性克隆进行测序。通过组合3'-末端和相应的序列获得全长cDNA序列。