《表1 本研究使用的引物：意大利蜜蜂幼虫肠道在球囊菌侵染前期的差异表达microRNA及其调控网络》

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《意大利蜜蜂幼虫肠道在球囊菌侵染前期的差异表达microRNA及其调控网络》

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通过Stem-loop RT-qPCR检测4个随机选取的mi RNA（novel-m0031-3p、novel-m0034-5p、mi R-3793-x和ame-mi R-6000a-5p）在Am CK和Am T中的表达情况，以验证s RNA-seq数据的可靠性。根据所选mi RNA的序列，参照CHEN等[20]的方法，利用DNAMAN软件（Lynnon Biosoft公司，美国）设计特异性的Stem-loop引物、上游引物和通用的反向引物，委托上海生工生物工程有限公司进行引物合成。选择snRNA U6作为内参。利用RNA抽提试剂盒（Axygen公司，美国）分别提取AmCK和AmT的总RNA，利用Stem-loop引物进行反转录得到相应的c DNA作为模板进行PCR和q PCR。常规PCR体系为50μL，包括PCR mix（Ta Ka Ra公司，日本）25μL、无菌水17.5μL、正、反向引物及c DNA模板各2.5μL。反应程序如下:95℃5 min，95℃30 s，50℃30 s，72℃1 min，34个循环，72℃5min。随后利用1.8%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR的产物。qPCR反应体系（20μL）:SYBR Green Dye 10μL，正、反向引物各1μL，c DNA模板1μL，Rox 0.44μL，DEPC水补至20μL。在ABI 7500荧光定量PCR仪（ABI公司，美国）中进行反应，反应条件:95℃1 min，95℃15 s，49—60℃60 s，共40个循环，熔解曲线默认系统程序。所选mi RNA的相对表达量采用2-ΔΔCt法计算。每个反应进行3次生物学重复和3次技术重复。最后利用GraphPad Prism 5软件进行qPCR结果的检验及绘图。本研究使用的引物序列信息详见表1。