《表1 本研究使用的引物：意大利蜜蜂幼虫肠道在球囊菌胁迫后期的差异表达微小RNA及其靶基因分析》

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《意大利蜜蜂幼虫肠道在球囊菌胁迫后期的差异表达微小RNA及其靶基因分析》

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根据DEmiRNAs的序列信息，利用DNAMAN软件设计stem-loop引物、正向引物和通用反向引物，并委托上海生工生物工程公司合成相关引物。本研究使用引物信息详见表1。利用RNA抽提试剂盒（Axygen公司，美国）分别提取Am CK和Am T的总RNA，利用stem-loop引物进行反转录获得相应的cDNA模板。常规PCR体系为20μL:PCR mix（TaKaRa公司，日本）10μL，无菌水7μL，上下游引物（1.67μmol/L）及cDNA模板各1μL。反应程序:95℃3 min；95℃30 s，49℃30 s，72℃1 min，34个循环；72℃5 min。PCR的产物经1.8%的琼脂糖凝胶电泳检测。qPCR检测采用SYBR Green法在ABI QuantStudio 3荧光定量PCR系统（ABI公司，美国）中进行，反应体系为20μL:SYBR Green Dye 10μL，上下游引物（1.67μmol/L）以及cDNA模板各1μL，Rox 0.44μL，DEPC水补至20μL。反应条件:95℃预变性1 min；95℃变性15 s，49℃延伸30 s，40个循环；最后72℃延伸45 s。以U6作为内参，所选mi RNAs的相对表达量采用2-ΔΔCt公式进行计算。对每个生物学重复样品进行3次技术重复。最后通过Graph Prism 5软件对DEmiRNA的qPCR结果和s RNA-seq结果进行绘图。