《表1 本研究使用的引物：蜜蜂球囊菌菌丝和孢子中微小RNA及其靶mRNA的比较分析》

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《蜜蜂球囊菌菌丝和孢子中微小RNA及其靶mRNA的比较分析》

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随机选取5个DEmiRNA(miR5658-x、mi R-10285-y、miR-3245-y、miR4404-x、mi R-9-z）进行Stem-loop RT-qPCR验证。参照CHEN等[33]和郭睿等[34]的方法，利用DNAMAN软件（Lynnon Biosoft公司，美国）设计上述DEmiRNA的Stem-loop引物、特异性上游引物和通用下游引物。委托上海生工生物工程股份有限公司合成引物（表1）。利用总RNA抽提试剂盒（Promega公司，中国）分别抽提菌丝和孢子的总RNA，然后用RNase-free DNase I去除各自基因组DNA残留。吸取1μL RNA，用NanoDrop One(Thermo Scientific公司，美国）分别对菌丝、孢子的RNA浓度进行测定。利用Stem-loop引物，按照cDNA第1链合成试剂盒（TaKaRa公司，日本）说明书进行总RNA的反转录，得到的c DNA作为模板进行qPCR。选用球囊菌的actin(5417）作为内参基因。反应体系为20μL:SYBR Green Dye 10μL，特异性上游引物1μL，通用下游引物1μL，c DNA模板1μL，RNA-Free H2O 7μL。每个反应进行3次技术重复。采用2-ΔΔCt法计算DEmiRNA的相对表达量，然后利用GraphPad Prism 7软件进行Student’s t-test检验及绘图。