《表1.本研究使用的引物：中华蜜蜂6日龄幼虫响应蜜蜂球囊菌胁迫的环状RNA应答》

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《中华蜜蜂6日龄幼虫响应蜜蜂球囊菌胁迫的环状RNA应答》

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为验证circ RNA-seq数据的可靠性，随机选取3个DEcirc RNA （novel＿circ＿000645、novel＿circ＿001097和novel＿circ＿000339）进行RT-q PCR。参照Guo等[23]的方法，根据所选circ RNA的碱基序列，利用DNAMAN软件设计相应的特异性反向引物，扩增区域跨反向剪切位点，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物。选择actin基因（LOC108004261）作为内参。相关引物信息详见表1。利用RNA抽提试剂盒（Ta Ka Ra公司，中国）分别提取Ac CK和Ac T样品的总RNA，分为2份，其中1份总RNA用3 U/mg RNase R （吉赛生物，中国）进行消化，以去除线性RNA，37°C处理15 min，70°C处理10 min，后以随机引物进行反转录，得到c DNA作为circ RNA的q PCR模板；另一份总RNA直接作为模板，以Oligo （d T）23作为引物进行反转录，得到对应的c DNA，作为actin的q PCR模板。反应体系（20μL）包含：正、反向引物（10.0μmol/L）各1μL，c DNA模板DNA 1μL，SYBR Green Dye 10μL，DEPC水7μL。反应在ABI Quan Studio 3荧光定量PCR仪（Thermo Fisher公司，美国）上进行，程序如下：95°C 1 min，95°C15 s，60°C 30 s，45个循环。每个反应进行3次技术重复和生物学重复。采用2–△△C t法[47]计算上述DEcirc RNA的相对表达量。Graphpad Prism 7软件进行Student’s t test及相关绘图。