《表1 本研究使用的引物：微小RNA介导东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂的分子机制》

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《微小RNA介导东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂的分子机制》

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随机在NcCK vs NcT1、NcCK vs NcT2和NcT1 vs NcT2中分别选取5、3和5个mi RNA，根据成熟mi RNA的序列，利用Premier 6软件设计Stem-loop引物、特异性上游引物和通用下游引物。委托上海生工生物工程股份有限公司合成引物（表1）。利用RNA提取试剂盒（TaKaRa公司，日本）抽提各样品的总RNA，利用Stem-loop引物和c DNA第一链合成试剂盒合成mi RNA的c DNA，作为模板进行qPCR验证。qPCR体系（20μL）包括：SYBR Green Dye 10μL，上下游引物（4μmol·L-1）各1μL，c DNA模板1μL，Rox 0.44μL，DEPC水补至20μL。选择东方蜜蜂微孢子虫的5S rRNA作为内参。反应体系在ABI QuantStudio 3荧光定量PCR系统（ABI公司，美国）中运行。反应程序：95℃1 min；95℃15 s，49℃30 s，共40个循环。每个样品进行3次重复。Mi RNA的相对表达量根据2-ΔΔCt算法计算得出。利用Graph Prism 7进行数据计算并绘图。