《表2 q RT-PCR引物序列》

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《铜绿假单胞菌中T3SS毒力基因分布、表达及与抗菌药物耐药相关性研究》

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用Trizol一步法提取细菌总RNA，并用紫外可见分光光度计检测其浓度。参照逆转录试剂盒说明书将提取的总RNA经二步法反转录合成cDNA。逆转录反应体系及条件:第一步，RNA 4μL，随机引物1μL，DEPC水7μL，共12μL，65℃5 min；第二步，5×Reaction Buffer 4μL，RNA酶抑制剂1μL，dNTP 2μL，Revert Aid反转录酶1μL，共8μL，混匀，42℃60 min，最后70℃5 min终止反应。q RT-PCR采用SYBR GREEN染料法进行，反应体系:蒸馏水6.4μL，SYBRGreen Realtime PCR Master Mix 10μL，10μmol/L上、下游引物（引物序列见表2）各0.8μL，cDNA 2μL。反应条件:95℃30 s；95℃5 s，58℃退火10 s，72℃延伸15 s，进行40个循环，最后进行熔解曲线分析，以铜绿假单胞菌PAO1为参照菌株，以16S r RNA为内参基因。采用2-△△Ct公式计算效应蛋白基因在铜绿假单胞菌临床分离菌株中的相对表达量:△Ct（实验样本）=Ct（实验样本目的基因）-Ct（实验样本内参基因），△Ct（参照样本）=Ct（参照样本目的基因）-Ct（参照样本内参基因），-△△Ct=△Ct（参照样本）-△Ct（实验样本）。