《表2 CDV-3株c DNA克隆构建用引物序列》

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《犬瘟热病毒CDV-3株感染性克隆的构建与鉴定》

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利用软件DNAMAN分析1.2.1中所获得的CDV-3株全基因组序列的单一性酶切位点，选取适当的位置作为衔接点。利用Primer Premier 5.0设计特异性引物（表2），为了便于拼接，引物两端携带相应的酶切位点。用1.2.1中合成的c DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物依次命名为：F1、F2、F3、F4和F5。其中，引物F1F的5′端加入了SpeⅠ酶切位点（斜体）和锤头状核酶序列（黑体）。引物F5R的5′端加入了部分丁型肝炎核酶序列（黑体）。之后，改造载体pc DNA3.1的多克隆位点，用内切酶PmeⅠ酶切pc DNA3.1，连接入事先制备的双链DNA （上游引物：5′-GGC CGCATTTCGTACGAATTTTGTACATTTCGGTCC GACCTGGGCATCCGAAGGAGGACGCACGTCC ACTCGGATGGCTAAGGGAGGGCG-3′；下游引物：5′-CGCCCTCCCTTAGCCATCCGAGTGGAC GTGCGTCCTCCTTCGGATGCCCAGGTCGGAC CGAAATGTACAAAATTCGTACGAAATGC-3′），最终pc DNA3.1的多克隆位点变为NheⅠ-NotⅠ-BsiwⅠ-Bsp1407Ⅰ-CpoⅠ-部分丁型肝炎核酶序列，改造后的pc DNA3.1称为pc DNA3.2。将F1连接至p EASY-Blunt，获得p EASY-Blunt-F1，SpeⅠ和NotⅠ双酶切p EASY-Blunt-F1，回收纯化F1片段；NheⅠ和NotⅠ双酶切pc DNA3.2，回收纯化载体片段；SpeⅠ和NheⅠ属于同尾酶，T4 DNA连接酶连接F1片段和pc DNA3.2载体片段，获得pc DNA3.2-F1。将F2和F3分别连接到克隆载体p EASY-Blunt Simple或p EASY-Blunt上获得p EASY-Blunt-F3和p EASY-Blunt-F2。用NotⅠ和NdeⅠ分别双酶切p EASY-Blunt-F3和p EASY-Blunt-F2，回收纯化F2片段和F3载体部分，T4DNA连接酶连接，获得p Blunt-F2-F3。将F4和F5片段分别连接到克隆载体p EASY-Blunt上，获得p EASY-Blunt-F4和p EASY-Blunt-F5。NotⅠ和Bsp1407Ⅰ分别双酶切p EASY-Blunt-F4和p EASY-Blunt-F5，回收纯化F4片段和F5载体片段，T4DNA连接酶连接，获得p Blunt-F4-F5。用BsiwⅠ和CpoⅠ双酶切p Blunt-F4-F5和pc DNA3.2-F1，回收纯化F4-F5片段部分和pc DNA3.2-F1载体部分，连接酶连接获得pc DNA3.2-F1-F4-F5。PmeⅠ和BsiwⅠ双酶切pc DNA3.2-F1-F4-F5和p Blunt-F2-F3，回收纯化F2-F3片段和pc DNA3.2-F1-F4-F5载体部分，T4DNA连接酶连接，获得CDV-3全基因组重组质粒pc DNA3.2-CDV-3。最后用PmeⅠ和Bsp1407Ⅰ双酶切鉴定全长重组质粒，筛选出正确的重组子pc DNA3.2-CDV-3 （图1）。按照Endo Free Plasmid Maxi Kit的操作说明，大量提取全长重组质粒pc DNA3.2-CDV-3，测定浓度后分装，于-70℃保存待用。