《表3 肝素异构酶酶学性质表》

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《肝素C5异构酶的表达优化及分子改造》

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根据已报道的酶晶体结构分析，经分子对接，选择距离底物结合口袋5?范围内的氨基酸位点，以pColdⅢ-SET2-C5为模板，对V153、D155、Q185、K397、G399、N478、D529、D545进行饱和突变。获得催化活性显著提高的突变体V153R，胞内上清酶液纯化后比酶活达到（145.14±2.33）U/mg。反应动力学常数显示其Km值由原来的（1.922±0.131）mmol/L降低至（0.941±0.083）mmol/L，催化常数kcat/Km由（16.129±0.111）增加至（44.633±0.547）L/（s·mol）；突变体G399E Km值降低至（1.525±0.273）mmol/L，催化常数kcat/Km增加至（22.951±0.146）L/（s·mol）、D545Y Km值降低至（1.366±0.196）mmol/L，催化常数kcat/Km增加至（27.086±0.102）L/（s·mol），说明突变体与底物的亲和力增加。原因可能是由于底物带有较强的负电荷，当153位氨基酸由侧链不带电荷的缬氨酸变为带有正电荷的精氨酸时，异构酶底物结合口袋局部环境中的正电荷强度增加（如图4A、4B所示），且突变后（图4B）相比突变前（图4A），侧链更长，距离底物更近，底物更容易进入结合口袋；399位氨基酸突变前后如图4C、4D所示，突变前399位甘氨酸（图4C）与底物只有一个氢键作用力，突变为谷氨酸（图4D）后相比突变前氢键作用力增加，但同时底物结合口袋负电荷强度也增加；545位氨基酸突变前后如图4E、4F所示，突变前545位天冬氨酸（图4E）与底物没有作用，突变为酪氨酸后（图4F）与底物增加了疏水作用力，同时突变后底物结合口袋局部负电荷强度变弱，因此以上3个氨基酸位点可能发生多重作用力的叠加，导致催化活性呈现不同程度的提高。基于以上结果对153R、399E、545Y 3个单点突变体进行了两两叠加突变，并未发现明显效果（数据未展示）。