《表1 比对统计表：铁皮石斛DoSMT2基因的克隆与表达分析》

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《铁皮石斛DoSMT2基因的克隆与表达分析》

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根据转录组测序获得的Do SMT2基因片段序列信息设计3?RACE引物3SMT1和3SMT2及接头引物d T-adaptor和adaptor （表1）。用引物3SMT1和d T-adaptor进行第一轮PCR，引物3SMT2和adaptor进行第二轮PCR。第一轮PCR以混合的c DNA为模板，第二轮PCR以第一轮PCR产物稀释10倍为模板。反应体系总体积25μL：包括Sterilized dd H2O8.5μL，2×San Taq PCR Mix 12.5μL，引物各1μL，模板2μL。PCR反应程序为94℃预变性5 min，然后94℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环，最后72℃延伸10 min。第二轮PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收目的片段，把目的片段与p MD19-T载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，复苏后把菌液涂在含100 mg/L氨苄青霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜。挑取单菌落，接种于含100 mg/L氨苄青霉素的液体LB培养基中过夜培养，利用引物3SMT2和adaptor进行菌落PCR，产物经电泳检测，阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。用软件DNAMAN V 6.0对测序结果进行拼接和比对。