《表1 LV-Cas9-Puro基因的引物序列》

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《利用CRISPR/Cas9慢病毒载体构建敲除大鼠肝星状细胞COX-2基因的细胞模型》

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（1）准备目的细胞:HSC-T6细胞的复苏、传代和冻存同前所述293T细胞的培养方法。（2）细胞转染:（1）Lenti-Cas9-puro病毒转染HSC-T6细胞，构建稳定表达Cas9蛋白的HSC-T6细胞，收集细胞标记为HSC-T6-Cas9细胞，进行下一步实验。（2） Real-time PCR检测Cas9病毒转染HSC-T6细胞后的表达情况:提取总RNA，逆转录获得c DNA（按照Promega公司提供的逆转录试剂盒操作步骤进行)将得到的产物c DNA-20℃保存备用，最后进行Real-time PCR，LV-Cas9-Puro基因的引物由广州市锐博生物科技有限公司设计合成，引物序列如表1，按比例配置反应体系（12μl体系），反应结束后通过制作熔解曲线确认为单峰曲线，基因表达量用相对定量分析法。（3）HSC-T6-Cas9细胞的冻存、复检:q PCR检测结果合格后进行HSC-T6-Cas9细胞冻存，至少冻存6支，冻存2～3 d，任意复苏1支，显微镜下观察复苏细胞状态。(4） Lenti-COX-2-sgRNA-EGFP病毒转染HSC-T6-Cas9细胞:（1）在上一步实验的细胞基础上，将细胞分为3组，分别为KO1组（Lenti-COX-2-sgRNA-1病毒转染组）、KO2组（Lenti-COX-2-sgRNA-2病毒转染组）、KO3组（Lenti-COX-2-sgRNA-3病毒转染组），加入相对应的Lenti-COX-2-sgRNA-1、Lenti-COX-2-sgRNA-2、Lenti-COX-2-sgRNA-3病毒进行感染。同时设立NC组（LentiNC病毒转染组）、CON组（HSC-T6细胞）。（2）感染72 h左右，在荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光的表达状况，估计荧光率；（3）分别用含1μg/ml puromycin的培养液培养传代细胞，得到COX-2基因敲除的HSC-T6-COX-2-/-混合细胞，分别标记为HSC-T6-COX-2-/--1细胞、HSC-T6-COX-2-/--2细胞、HSC-T6-COX-2-/--3细胞，并收集细胞做下一步检测。（5） LentiNC-EGFP病毒转染HSC-T6细胞:根据MOI值，感染Lenti-NC-EGFP病毒，在荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光的表达情况，估计荧光率，收集细胞做下一步检测，标记为HSC-T6-NC细胞。