《表1 目的基因的引物序列》

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《兽用抗生素磺胺二甲嘧啶对稻田N_2O排放的影响及其微生物机制》

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1) Y=C/T，S=C/G，V=A/C/G，W=A/T，H=A/C/T，K=G/T，R=A/G

施肥后每周采集土样一次.各小区采用梅花形布点法用土钻采集0～10 cm土壤样品，制成混合样，取好的土壤样品分别装入自封袋，标记密封带回实验室后迅速过2 mm筛并置于-20℃冰箱保存，用于测定土壤NH+4-N、NO-3-N和基因丰度指标.结合N2O测定结果及施肥日期，选取6月9日、6月22日、7月6日、7月21日、8月4日、8月24日及收获日11月11日测定相关土壤微生物功能基因丰度.每次气体采样同时，用MP-406Ⅲ型土壤水分温度测定仪（南通中天精密仪器有限公司）测定5cm深度的土壤温度和土壤水分（体积比），根据土壤容重将体积水分换算成土壤空隙含水量（WFPS）；土壤NH+4-N、NO-3-N测定方法为:将土壤用2 mol·L-1的氯化钾溶液浸提，振荡过滤后用连续流动分析仪（型号:AA3，SEAL Analytical，产地:英国）进行测定.土壤样品全基因组的提取采用PowerSoilDNA Isolation kit强力土壤DNA提取试剂盒法.所提取的土壤总DNA的浓度用NanoDrop2000超微量紫外分光光度计测定.所有样品的DNA浓度调节为10 ng·μL-1后，采用实时荧光定量PCR技术测定各基因丰度.采用统一程序扩增所有的基因，PCR扩增采用20μL反应体系:6.8μL ddH2O；0.4μL Forward Primer（10μmol·L-1），0.4μL Reverse Primer（10μmol·L-1），即正反向引物各0.4μL；10μL扩增酶混合物SYBR Premix Ex TaqTM（2×）；0.4μL ROXReference Dye（50×）；2μL DNA模板.扩增程序为:95℃30 s；95℃5 s，55℃30 s，72℃1 min，40个循环；95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s.引物及相应扩增程序见表1.