《表1 引物序列信息：红花檵木LcDRF1和LcDRF2基因克隆及亚细胞定位分析》

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《红花檵木LcDRF1和LcDRF2基因克隆及亚细胞定位分析》

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基于红花檵木转录组测序结果，从中筛选到3个DFRs同源c DNA序列，经序列分析发现仅有2个基因包含有完整的开放阅读框（ORF），长度分别为1014和993 bp，分别命名为Lc DFR1和Lc DFR2。利用Primer Premier 5.0设计这2个基因5'-非编码区（5'-UTR）和3'-UTR区域的特异引物DFR1-F/DFR1-R和DFR2-F/DFR2-R（表1），用于扩增Lc DFR1和Lc DFR2基因c DNA序列（包含部分5'-UTR、3'-UTR及完整ORF）。以c DNA第一链为模板，利用Prime STAR GXL DNA聚合酶扩增Lc DFR1和Lc DFR2基因c DNA序列。反应体系25.0μL:5×Prime STAR GXL Buffer 5.0μL，2.5 mmol/L d NTP Mixture 2.0μL，10mmol/L上、下游引物各0.5μL，c DNA模板0.3μL，Prime STAR GXL DNA聚合酶0.5μL，灭菌水补足至25.0μL。扩增程序：95℃预变性2 min；98℃10 s，55℃15 s，68℃80 s，进行35个循环；72℃延伸5 min，10℃保存。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，挑取条带大小正确的目的片段送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行双向测通，以确定转录组数据中Lc DFR1和Lc DFR2基因c DNA序列的正确性。