《表1 引物序列信息：芒果MiZFP1和MiZFP2基因克隆与表达模式分析》

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《芒果MiZFP1和MiZFP2基因克隆与表达模式分析》

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在前期研究中，通过基因差异显示已获得芒果MiZFP1和MiZFP2基因的3'末端序列，因此本实验只需克隆两个基因的5'末端序列即可通过序列拼接获得全长。MiZFP1和MiZFP2基因5'末端的克隆采用罗聪等（2011）改良的RACE技术。在拼接获得全长后，继续设计一对能够扩增基因完整开放阅读框的引物验证拼接序列的正确性，引物设计采用在线设计软件Primer3 Input（http://primer3.ut.ee/），引物序列信息已列出（表1）。芒果MiZFP1和MiZFP2基因全长序列克隆PCR反应体系为25μL，其中10 mmol/L dNTP 0.5μL、10×PCR Buffer 2.5μL、10μmol/L上下游引物各1μL、Dream Taq 0.15μL、c DNA模板1μL、补双蒸水至25μL。PCR程序为：预变性95℃3 min；变性95℃30 s；退火55℃30 s；延伸72℃60 s；共扩增36个循环；最后72℃延伸8 min。扩增产物经1.8%琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收大小符合预期的目的片段，通过TA克隆、连接、转化、菌落PCR鉴定和测序，获得目的序列，并保存测序正确的大肠杆菌菌液。