《表1 预习学案：山核桃赤霉素氧化酶基因CcGA3ox的克隆和功能分析》

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《山核桃赤霉素氧化酶基因CcGA3ox的克隆和功能分析》

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注：GGATCC、GTCGAC分别为Bam HⅠ、SalⅠ的酶切位点。

根据山核桃Cc GA3ox基因的全长CDS序列，按照喏唯赞Clone Express II One Step Cloning Kit试剂盒的操作要求，基于In-Fusion的载体构建技术[49]进行构建载体，利用Premier 5.0软件设计克隆引物，其序列见表1。根据Saito等[50]的PCR扩增体系进行扩增，并调整PCR反应程序为：94℃预变性2 min；98℃变性10 s；55℃退火30 s；68℃延伸2 min；共32个循环；68℃延伸7 min。将PCR反应产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，同时，将p C1300质粒进行Bam HⅠ和SalⅠ双酶切，分别胶回收目的条带和双酶切电泳产物，将目的条带和酶切后的质粒载体进行连接，将连接产物35S::Cc GA3ox::GFP转入DH5α大肠杆菌感受态细胞[51]，取阳性单克隆菌株进行PCR鉴定并送至杭州有康生物技术有限公司测序鉴定，测序结果比对正确的质粒转化农杆菌[52]，PCR验证正确的菌株用于保菌及后续实验。将克隆获得的序列拟命名为Cc GA3ox，并将构建的过表达载体拟命名为35S::Cc GA3ox::GFP。