《表1 phyB突变体T0代靶位点突变基因型的鉴定分析》

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《利用CRISPR/Cas9基因编辑技术创制水稻光敏色素PHYB基因突变体》

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注:蓝色碱基:PHYB基因靶序列；黄色高亮碱基:PAM序列；红色短线:碱基缺失；小写红色碱基:插入碱基；-:缺失；+:插入Note:Blue bases:Target sites of PHYB gene；Yellow highlight bases:PAM sequence；Red short lines:Bases deletion；Lowercase red bases:Bases insertion；-:Deletion

根据酶切分析的结果，本研究将发生突变的6个单株（1，2，4，6，7，8）进行测序分析，进一步确认靶位点突变基因型。特别是杂合及双等位突变，由于突变引起的两同源染色体碱基序列不同，导致其突变位点附近测序峰图出现套峰（图2B；图2C），致使无法准确判断读取其突变碱基序列，因此该类突变体需通过TA克隆，随机选取单克隆进行测序分析。单株2、单株4、单株6、单株7、单株8的单克隆测序结果与酶切分析结果一致，均产生了不同类型的碱基突变（表1）。有趣的是，单株1测序结果显示其为双等位突变体，与PCR产物酶切显示的杂合突变结果不一致，进一步分析突变基因型发现，其两条同源染色体靶位点在PAM序列前第3和第4碱基之间分别插入1个碱基“A”和碱基“T”。其中，碱基“T”的插入并未造成限制性内切酶Bsu15Ⅰ识别序列的改变（5'-AT▼CGATT-3'；三角为Bsu15Ⅰ切割位点；下划线碱基为插入“T”），因此Bsu15Ⅰ仍能切割该条突变的同源染色体使其产生杂合突变的酶切带型，造成了酶切结果和测序结果判读的不一致。4和8两个单株均为缺失1 bp的纯合突变类型；单株2、单株6和单株7均为靶位点处1条同源染色体插入碱基“A”和另1条同源染色体缺失2 bp的双等位突变类型。对6个单株的测序分析显示，本研究共获得了4种突变基因型的phyB突变体。