《表1 本研究中所用引物序列》

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《三疣梭子蟹14-3-3基因的克隆及其在低盐和病原胁迫后的表达分析》

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利用Trizol试剂提取不同实验组三疣梭子蟹鳃和肝胰腺组织的总RNA，使用Prime Script RT reagent Kit反转录合成c DNA。根据已获得的三疣梭子蟹内参基因β-actin和Pt14-3-3基因全长序列，利用Primer Premier 5.0软件设计2对正反引物（β-actin-F和β-actin-R；Q14-3-3-F和Q14-3-3-R）（表1），使用SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂在ABI 7500 Real Time PCR仪上对不同处理组获得的Pt14-3-3基因进行实时荧光定量检测。荧光定量PCR反应体系为20μl:10μl SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（2×），0.8μl 10μmol/L的引物Q14-3-3-F，0.8μl 10μmol/L的引物Q14-3-3-R，0.4μl ROX Reference DyeⅡ（50×），2.0μl c DNA模板，6.0μl无菌dd H2O。反应程序：95℃30 s，95℃5 s，60℃34 s，40个循环；95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s。采用2-（35）（35）Ct计算Pt14-3-3基因的相对表达量，使用SPSS 17.0软件进行单因素方差（One-way ANOVA）分析。