《表1 本实验所使用的引物》

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《表达KsdD重组大肠杆菌的构建及转化工艺优化》

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注：ksdd-F及ksdd-R下划线分别为NcoⅠ和HindⅢ的酶切位点。NcoⅠin ksdd-F and HindⅢin ksdd-R sites are underlined.

首先根据已报道的ksdd R2（GenBank:KU257604）、ksdd M(GenBank:GQ228843.1）及KsdDA(GenBank:BAA07186.1）的基因序列设计引物（表1），采用细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取R.rhodochrous DSM43269、M.neoaurum TCCC 11028 MNR及A.simplex CPCC 140451基因组DNA，并以获得的基因组序列为模板，通过表1中的引物对目的基因ksdd序列进行扩增。将获得的基因片段与大肠杆菌表达载体pET28a经限制性内切酶Nco I和Hind III双酶切后，按插入片段:载体片段=3:1的比例进行连接，分别获得重组表达质粒pET28a-KsdDR2、pET28a-KsdDM及pET28a-KsdDA。然后将成功构建的重组质粒经化学转化法分别转入大肠杆菌BL21(DE3）感受态细胞中，37℃培养过夜，挑取阳性克隆子，经金唯智公司测序验证后，获得分别含有目的基因KsdDR2、KsdDM及KsdDA的重组大肠杆菌表达菌株。