《表1 KMT2D sgRNA序列》

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《利用CRISPR/Cas9技术构建KMT2D基因敲除的人胚胎干细胞系》

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根据NCBI和UniProt上公布的KMT2D序列，利用张峰实验室提供的网站进行靶点分析设计sgRNA，针对SET Domain前后两个位置寻找合适的靶点，按照分数从高到低的顺序合成sgRNA。合成序列见表1。将合成的sgRNA寡核苷酸链（100μL）退火，正链与负链各3μL，10×NEB BufⅡ5μL，ddH2O补足至50μL。混匀后置于PCR仪中，设置退火程序:95℃10:00 min；95℃到85℃Ramp:1.0℃/sec；85℃到25℃Ramp:0.1℃/sec；16℃forever。退火后，形成双链片段，用于后续实验。