《表1 sgRNA双链序列》

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《蒙古牛无角POLLED位点的定点编辑》

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sgRNA：单导向RNA；小写字母：酶切位点

根据POLLED序列（NCBI:AC＿000158.1:1705834～1706045），通过在线网站http://crispr.mit.edu/设计单导向RNA（single guide RNA，sgRNA）。筛选出网站评分前4位的sgRNA序列，根据ORI-GENE公司载体构建说明书设计sgRNA（表1），长度为20 bp，两端添加Bam HⅠ和Bsm BⅠ酶切位点，经TaKaRa公司（大连）合成，得到带有粘性末端的双链sgRNA序列。然后与Bam HⅠ、Bsm BⅠ双酶切的pCas-Guide-EF1α-GFP骨架载体于16℃过夜连接，转化大肠杆菌（Escherichia coli）感受态细胞DH5α，挑取单克隆菌株扩增。菌液交由华大基因（北京）测序，验证sgRNA双链是否正确连入载体。