《表1 引物序列：丝瓜籽核糖体失活蛋白Luffin-α的基因克隆、表达及抗肿瘤活性研究》

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《丝瓜籽核糖体失活蛋白Luffin-α的基因克隆、表达及抗肿瘤活性研究》

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反转录的操作步骤根据TAKARA公司反转录试剂盒说明书进行。根据GeneBank中的Luffin-α的cDNA序列，设计合成引物Luffin-F1和Luffin-R1，扩增丝瓜Luffin-α基因，引物设计和测序均由上海铂尚生物有限公司完成，引物序列见表1。反应体系如下：cDNA 2μL，10×PCR Buffer 5μL，dNTP（2.5mol·L-1）2μL，Taq酶（1U·μL-1)0.5μL，正反向引物各1μL，ddH2O 38.5μL，总计50μL。反应条件如下：94℃预变性3min，98℃20s，61℃45s，68℃45s，2个循环；98℃20s，59℃45s，68℃45s，3个循环；98℃20s，57℃45s，68℃45s，共28个循环。结束后，通过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，然后按照Axygen公司的胶回收试剂盒内附说明书进行切胶回收。PCR产物与pTA2载体进行T-A克隆，连接产物转化至TG1感受态细胞中，均匀涂布在含Amp的LB固体培养基上，37℃培养12h。随机挑取6到8个菌落，菌落经PCR初步鉴定后，再寄送至上海铂尚生物有限公司测序。测序结果通过NCBI上的Blast软件进行比对。