《表1 RT-qPCR所用引物序列》

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《变应性鼻炎合并鼻息肉患者免疫治疗前后外周血叉头状转录因子p3与细胞抗原识别受体Vγ亚家族基因表达的特点》

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使用Ficoll密度梯度离心法提取外周血中单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC），参照试剂盒说明提取总RNA (RNAiso Plus试剂盒，TaKaRa，Japan）并反转录合成cDNA第一链（PrimeScriptTMRT Master Mix试剂盒，TaKaRa，Japan），以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）基因作为内参基因，检测Foxp3与TCR VγⅠ～Ⅲ亚家族基因的表达水平（FastStart Universal SYBR Green Master试剂盒，Roche，Germany）[13]。引物由上海生工生物公司合成，引物序列见表1，其中根据TCR Vγ基因的3个亚家族分别设计3条上游引物（VγⅠ～Ⅲ），并设计一共同下游引物Cγ。总反应体系为20μL，包括1μL cDNA、1μL上游引物（0.6μmol/L）、1μL下游引物（0.6μmol/L）、10μL ddH2O以及10μL 2×FastStart Universal SYBR Green Master；每例标本设置2个复孔，在95℃预变性10 min后进行40个循环扩增，每一循环包括95℃10 s、60℃30 s，并以0.5℃/s变化速度在60℃～95℃每隔5 s记录1次荧光值，以获得熔解曲线[16]。反应在CFX96TM Real-Time PCR cycler (BioRad，USA）中进行。为排除假阳性结果，所有样品均设置无模板阴性对照。采用比较Ct法分析各组目的基因的mRNA相对于GAPDH基因的表达水平。