《表2 转基因大豆的RPA试纸条引物和探针序列》

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《转基因大豆RPA检测技术的建立及应用》

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RPA反应体系包括一对特异性引物和一条nfo探针，其中下游引物修饰有生物素B，nfo探针修饰有fluorescein isothiocyanate荧光素FITC。根据Nos终止子以及Nos163引物的序列，我们设计了Nos163的RPA引物和探针，序列见表2。如果反应体系中的模板DNA为转基因大豆基因组DNA，扩增产物会含有生物素B和FITC，扩增产物通过毛细作用从试纸条的加样点由下而上流动时，试纸条上会显现control band和test band两条条带。当为非转基因模板DNA或其他DNA时，试纸条上只显示control band一条带。1.2.5 RPA试剂条检测反应RPA试剂盒（TwistAmp nfo）和Milenia Hybridtech 1 strips（no nfo kits）试纸条均购自南京沃博生物科技有限公司，货号分别为TANFO02KIT和MILENIA01。RPA反应体系按试剂盒说明书进行混合，为了保证反应同时进行，2.5μL280 mmol/L醋酸镁溶液应该最后加在八连管的盖子上，小心翻转盖上，然后上下颠倒八连管混匀，离心。整个操作过程要在冰上进行。RPA反应在39℃恒温下反应4 min后，取出反应管进行涡旋震荡，点动离心，再在39℃恒温下反应26 min，反应结束后取5μL扩增产物滴加至试纸条检测区，再将95μL试纸条检测buffer加入到1.5 mL EP管中，最后将试纸条垂直放入试纸条检测buffer中，以质控线出现明显条带即可，3 min左右，待试纸条晾干后拍照。