《表1 荧光定量引物列表Tab.1 The primers of qRT-PCR used in this study》

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《大豆bHLH转录因子家族成员的进化及功能分化研究》

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大豆种子（Williams 82）使用50 m L 7%次氯酸钠和2 m L浓盐酸消毒16～20 h.将消毒后的种子放入用无氮营养液浸湿的蛭石/珍珠岩为1∶1的介质中，25℃黑暗培养2 d.转为25℃、光照（16h）/黑暗（8 h）条件下培养5 d后，将用无菌水洗涤后重悬的OD600为0.8左右的USDA110菌株浇到大豆根部.每3 d浇一次无氮营养液.取大豆不同组织样品于液氮中迅速冷冻，随后放入-80℃冰箱中冷藏.用Trizol Reagent（Invitrogen）提取不同时期大豆材料不同组织材料的总RNA.使用NANODROP ONE（Thermo）检测RNA样品浓度和纯度，记录数值.RNA样品置于-80℃保存.使用TIANGEN公司反转录试剂盒操作说明反转录获得cDNA第1链，将其在-20℃保存.随后以其为模板按照BIOTAKE公司Power 2×SYBR Real-time PCR Premixture操作说明进行qRT-PCR反应（LightCycler 96，Roche）.根据大豆bHLH基因CDS序列设计荧光定量引物（表1），内参基因为大豆β-actin基因.qRT-PCR反应体系为10μL Power 2×SYBR Premixture，0.6μL Forward Primer（10μm），0.6μL Reverse Primer（10μm），1μL cDNA，2.0μL ROX，3.8μL灭菌蒸馏水至20μL反应体系.采用三步法反应，PCR反应程序为95℃预变性2 min；95℃变性20 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s；45个循环.每个样品进行3次生物学重复，根据CT值进行目标基因相对表达量2ΔΔCT的计算[19].