《表3 目的菌群实时荧光定量PCR引物》

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《氧化锌对新生犊牛生长性能、免疫功能及直肠微生物菌群的影响》

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使用实时荧光定量PCR的绝对定量法对大肠杆菌和乳酸菌含量进行测定。首先，使用粪便基因组DNA提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司，DP328]提取粪便微生物总DNA，并测定浓度。以DNA为模板，用目的基因引物进行PCR扩增，引物由Invitrogen公司合成（表3）。反应完毕后，用1%琼脂糖凝胶电泳检查扩增结果，目的片段进行琼脂糖凝胶回收，回收的PCR产物进行TA连接，22℃连接约4 h，转化感受态细胞大肠杆菌DH5α，并涂布平板培养。挑取平板上的阳性克隆进行PCR鉴定，最后提取质粒作为绝对定量的标准品。质粒标准品从101～105进行10倍梯度稀释，每个梯度取2μL做模板建立标准曲线。乳酸菌标准曲线为:Y=-3.457X+37.37（R2=0.99）；大肠杆菌标准曲线为Y=-3.696X+47.579（R2=0.91）；其中Y为阈值Ct，X为拷贝数。使用Applied Biosystems 7500实时荧光定量仪和TaKaRa Ex TaqTMⅡ（ TliRNaseH Plus）、ROXplus试剂盒对样本DNA进行定量，每个样品3个重复，根据标准曲线与样品Ct值计算拷贝数。荧光定量体系为18μL，包括10μL 2×Master M ix，0.5μL上游引物，0.5μL下游引物，7μL灭菌水和2μL DNA。PCR扩增程序为:95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火30 s，40个循环；95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s。目的微生物的数量以每个样品中每克内容物细菌16S rRNA拷贝数的对数值[lg（拷贝数/g）]表示。