《表1 引物序列：野生型和功能增强型ADAMTS13蛋白酶分子的表达及功能鉴定》

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《野生型和功能增强型ADAMTS13蛋白酶分子的表达及功能鉴定》

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表注:标红的部分为需要突变的氨基酸序列。

利用引物设计网站www.genomics.agilent.com设计引物，在引物中引入特定的突变位点。配制50μL PCR反应体系，体系包含2μL模板质粒ADAMTS13（10 mg/L）、1.25μL IF、1.25μL IR、5μL 10×reaction buffer、1μL dNTP mix、3μL Quik Solution、36.5μL ddH2O，然后向体系中加入1μL PfuUltra HF DNA聚合酶，体系配制均在冰上操作。PCR反应条件:95℃预热1 min；95℃下解链50 s；60℃下退火50 s；68℃下延伸1 min，上述3个过程共循环18次；最后，68℃下维持7 min。取1μL的DpnΙ加入到反应后的PCR反应体系中，于37℃温水浴1 h，酶切消化模板质粒ADAMTS13，之后纯化PCR产物，将纯化后的PCR产物转化到DH5α感受态细胞，涂平板，挑选阳性克隆扩大培养，抽提质粒，测序，经比对无误后，以此质粒为模板进行下一个位点突变。鉴于最后三突变点的位置相隔较近，将这3个点设计到一个引物中。所以此次5个位点突变重复了3次上述步骤，3次实验的引物序列分别如下表1，每条引物中标红的部分为需要突变的氨基酸序列。