《表1 预测的LjE2s的基因信息、蛋白表达、酶活测定》

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《百脉根泛素结合酶LjE2的表达及活性鉴定》

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注:参考拟南芥的E2s分类将预测的百脉根E2s分为11个亚组。“Yes”表示成功表达和纯化蛋白，“No”表示没有蛋白，“ND”表示没有进行实验，“+”表示具有酶活，“-”表示不具有酶活。Note:GroupsⅠ-Ⅺare based on the classification of Arabidopsis E2s.“Yes”indicates good

为了检测泛素结合酶活性和建立百脉根体外泛素化系统，首先将百脉根中的Ub克隆到pGEX-4T1表达载体上，经表达纯化后得到泛素融合蛋白GST-Ub。考虑到GST可能对泛素化反应存在潜在的影响，利用来源于小麦的E1（WE1）、来源于人的E2（UBCH5B）和GST-Ub进行体外泛素化。结果显示:在WE1、UBCH5B和GST-Ub同时存在的样品中，检测到UBCH5B结合多聚泛素化链的高分子条带区段，说明融合蛋白GST-Ub可以传递给E2，而在70ku附近处有一条蛋白带，可能是GST-Ub（34ku）形成的二聚体（图3A）。以LjE2-7体外泛素化活性检测为例，在WE1、His-LjE2-7和GST-Ub同时存在的样品中，可以检测到His-LjE2-7结合泛素的高分子条带，说明LjE2-7具有泛素结合酶活性（图3B）。所有表达的蛋白（LjE2s）酶活检测结果表明，除了LjE2-5未检测到泛素结合酶活性外（图3G），其他9个LjE2s都具有泛素结合酶活性（图3B-F）。此外，由于未克隆到LjE2-4、LjE2-8、LjE2-12基因，也未能表达出LjE2-14蛋白，所以不但进化树分析结果显示，这4个预测的LjE2s很可确定这4个LjE2s是否具有E2泛素结合酶活性。能具有泛素结合酶活性（表1）。