《表1 参考物种信息：绵羊角蛋白关联蛋白2基因的克隆表达与生物信息学分析》

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《绵羊角蛋白关联蛋白2基因的克隆表达与生物信息学分析》

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扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，用胶回收试剂盒回收目的片段，取PCR回收产物4μL，pMD19-T载体1μL与5μL的SolutionⅠ混匀，4℃过夜，再将质粒pMD19-T-KAP2转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于氨苄抗性的固体LB平板，37℃培养12~16h。经蓝白斑筛选后，接种到氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃继续培养，取菌液用DNA质粒提取试剂盒提取质粒，操作步骤按试剂盒进行，对重组质粒进行BamHⅠ和SalⅠ双酶切及PCR鉴定。PCR酶切体系20μL:pMD19-T-KAP2重组质粒8μL，BamHⅠ、SalⅠ各1μL，10×Buffer 2.0μL，ddH2O 8μL，预计扩增片段大小为463bp。阳性产物送宝生物工程（大连）有限公司进行测序，并对测序结果进行生物信息学分析。1.2.6生物信息学分析采用EditSeq（DNAS-tar）对绵羊KAP2基因进行碱基组成分析；参考GenBank中的7种不同物种KAP2基因序列，采用MegAlign（DNAStar）进行各物种KAP2基因的同源性分析，并构建系统进化树，参考物种信息见表1；采用ProtParam（http:∥web.expasy.org/protparam/）对绵羊KAP2基因编码蛋白基本理化性质进行分析，并采用TMpred（http:∥www.ch.embnet.org/software）对KAP2蛋白跨膜区及跨膜方向进行预测；用在线GOR4工具对KAP2蛋白的二级结构进行预测，并用Protean（DNAStar）中的最优方法对克隆序列编码蛋白的二级结构进行分析，进一步利用SWISS-MODEL（https:∥swissmodel.expasy org/）预测三级结构。