《表2 优化后尺寸链环：芒果MiTFL1-4基因启动子克隆与生物信息学分析》

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《芒果MiTFL1-4基因启动子克隆与生物信息学分析》

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用本实验室改良的CTAB法提取芒果叶片的总DNA，稀释为100 mg/L，保存于-20℃冰箱。在参考李泽卿（2017）的TAIL-PCR基础上，将原有的三轮PCR扩增修改为四轮PCR扩增。在Mi TFL1-4基因组DNA全长的基础上设计4条嵌套特异性下游引物SP1/2/3/4，让其与8条随机简并引物AD结合，进行四轮PCR反应。第一轮PCR反应，使用芒果总DNA为模板，SP1特异性引物分别与简并引物AD1-AD8配对进行扩增，第二、第三、第四轮PCR反应，均使用上一轮PCR原液稀释40倍做模板，使用SP2/3/4与简并引物配对扩增，之后用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后确定条带，送PCR原液至广州擎科生物公司直接测序。将所得测序条带拼接，与已知区域DNA核对成功后，设上游引物p TFL1-4u，与下游特异性引物SP4进行PCR扩增后，使用胶回收试剂盒（生工，上海）进行胶回收，检测后与PMD18-T载体在16℃水浴下连接20 h，转化至DH5α大肠杆菌中，筛选后得到含有正确片段大小的大肠杆菌菌株送测序（表2）。