《表2 引物序列：罗布麻黄酮醇合成酶基因克隆及其生物信息学分析》

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《罗布麻黄酮醇合成酶基因克隆及其生物信息学分析》

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按照Ultrapure RNA Kit（DNaseⅠ）（超纯RNA提取试剂盒（DNaseⅠ）操作说明提取总RNA。按照PrimeScript 1stStrand cDNA合成试剂盒说明书合成cDNA。通过对已知植物FLS核苷酸序列进行同源性比对分析，找出高度保守区域，利用DNAMAN 6.0和Primer 6.0，根据简并性低和同源性高的原则，设计一对简并引物P1和P2（表2），扩增AvFLS基因的核心片段，PCR反应条件为：94℃预变性60 s，98℃变性10 s，55℃退火15 s，68℃延伸60 s，35个循环，最后72℃延伸10 min。根据所得的核心片段设计5'端特异引物P3（外侧引物）、P4（巢式引物）以及3'端特异引物P5（外侧引物）、P6（巢式引物），分别与试剂盒提供的引物（P7，P8）(表2） 进行配对，用于外侧和巢式PCR扩增，外侧PCR反应条件为：94℃预变性60 s，98℃变性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸60 s，30个循环，最后72℃延伸10 min。巢式PCR反应条件为：94℃预变性60 s，98℃变性10 s，55℃退火15 s，68℃延伸60 s，30个循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶检测，回收纯化的产物连接到T-vector p MD19载体，转化DH5α感受态细胞，阳性克隆送至苏州金维智测序，将测序得到的片段拼接得到AvFLS的全长c DNA，用DNAMAN 6.0预测ORF区，设计全长引物P9、P10（表2），通过PCR扩增得到目的条带，经回收纯化送苏州金维智测序。